2020/06/22
色譜法，又稱層析法.是一種以分配平衡為機理的分配方法，色譜體系包含兩個相,一個是固定相,一個是流動相。當兩相相對運動時，反復多次的利用混合物中所含各組分分配平衡性質的差異，達到彼此分離的目的。它是純化和分離有機或無機物的一種方法。
色譜法按固定相的狀態可分為柱色譜、平板色譜和棒色譜三種，而實驗室和實際中常用的是柱層析硅膠和薄層硅膠板，以及它們之間的配合應用。
柱層析硅膠
1.吸附色譜原理
在一定條件下硅膠與被分離物質之間產生作用，這種作用主要是物理和化學作用,兩種物理作用來自于硅膠表表面與溶質分子之間的范德華力，化學作用主要是硅膠表面的硅羥基與待分離物質之間的氫鍵作用。
2.柱層析硅膠的實際應用
以實驗室為例具體的操作步驟如下：
2.1 硅膠的準備
準備一定數量的柱層析硅膠，如200-300目的規格。
2.2實驗儀器準備
一支玻璃色譜柱柱,一個鐵架臺,燒杯,錐形瓶，徑口直徑較大的玻璃漏斗,一支玻璃棒。
2.3裝柱
2.3.1柱層析硅膠的加入
方法有干法和濕法兩種，下面具體介紹操作方法。
①干法:將硅膠一次加入色譜柱，振動管壁使其均勻下沉，然后沿管壁緩緩加入開始層析時使用的流動相，或將色譜柱下端出口加活塞，加入適量的流動相，旋開活塞使流動相緩緩滴出，然后自管頂緩緩加入硅膠，使其均勻地潤濕下沉，在管內形成松緊適度的吸附層。操作過程中應保持有充分的流動相留在硅膠的上面。
②濕法:將硅膠與流動相混合，攪拌以除去空氣泡，徐徐傾入色譜柱中，然后再加入流動相，將附著于管壁的吸附劑洗下，使色譜柱表面平整。填裝硅膠所用流動相從色譜柱自然流下，液面將柱表面相平時，即加試樣溶液.
2.3.2上樣
將試樣溶于層析時使用的流動相中，再沿色譜柱壁緩緩加入。注意勿使硅膠翻起。或將試樣溶于適當的溶劑中。與少量硅膠混勻，再使溶劑揮發去盡后使呈松散狀;將混有試樣的硅膠加在已制備好的色譜柱上面。如試樣在常用溶劑中不溶解，可將試樣與適量的硅膠在乳缽中研磨混勻后加入。
2.4洗脫與收集
除另有規定外，通常按流動相洗脫能力大小，遞增變換流動相的品種和比例，分別分部收集流出液，至流出液中所含成分顯著減少或不再含有時，再改變流動相的品種和比例。操作過程中應保持有充分的流動相留在硅膠的上面。
2.5樣品分離后的檢測
2.5.1初步檢測
當沖洗溶劑流出一定量后，可對流出液進行初步檢測，并且將錐形瓶更換成小試管進行收集.一般只進行初步的快捷檢測,因此通常是取薄層板,用鉛筆和直尺將硅膠板分劃成多個小方塊,并按照一定的次序編號取一根內徑為0.3mm左右的玻璃毛細管蘸取少量流出液，點于薄層板的一個小格內，待半點干后,然后用物理的或化學的方法檢測.
2.5.2正式檢測
①點樣:取分部收集的沖洗溶液進行分別直接點樣，如果沖洗溶液太稀,濃度太小，可先濃縮.點樣的容器一般用玻璃毛細管,點樣斑點的直徑一般為3-5mm。
②展開:在普通的展開槽中進行,展開方式常選用上行展開。
③展開劑:實用沖洗溶液。
④顯色:般常用物理檢測法和化學檢測法。物理檢測法中首先有紫外光法,紫外光常用兩種波長(254nm與365nm)，其次是碘蒸氣顯色法。化學檢出法通常用顯色劑直接噴霧，顯色劑有通用顯色劑和專用顯色劑，通用顯色劑常見的是硫酸-乙醇或甲醇(1:1)溶液,噴霧后,有的化合物立即反應，但多數化合物需加熱后經歷數分鐘才顯色,不同化合物的反應不同，所以顏色也往往不同。專用顯色劑是指對某個或某一類化合物顯色的試劑,利用化合物本身的特有性質,或利用其所含的某些官能團的特殊反應展開后根據斑點的，可以粗略的估計待分離物的含量的大小。
2.6合并處理
根據上面薄層板檢測的結果,我們可以將具有相同Rf值的部分進行合并，然后利用旋轉蒸發器對合并部分進行旋轉蒸發，得到我們需要的目標產物。
2.7色譜柱的洗滌
在絕大多數情況下,層析柱中的硅膠是一次性使用,但在使用后的色譜柱中由于還含有沖洗溶劑，所以要將里面的硅膠到出是比較困難的，取出硅膠的一種方法是將該柱管放置一段時間，讓溶劑自然揮發完后,倒出硅膠。但這種方法既費時又污染環境。第二種方法可以用一根比色譜柱稍長的木桿或塑料桿將含有溶劑的硅膠一段一段地掏出，但這種辦法也比較麻煩。第三種方法是利用一個一般的真空泵，經色譜柱中剩余的溶劑進行減壓抽出，在色譜柱和真空泵之間加一個冷阱，這樣抽出的溶劑既進行了有效地收集而不污染環境,而色譜柱中的硅膠又能較快得到干燥，使硅膠能夠方便地倒出。
3.色譜柱的選擇
常用的柱子可以分為:加壓,常壓,減壓。
壓力可以增加溶劑的流動速度，減少產品收集的時間，但是會減低柱子的塔板數。所以其他條件相同的時候，常壓柱是效率高的，但是時間也長，比如天然化合物的分離，一個柱子幾個月也是有的。
①減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺能夠節省一半甚至更多，但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發(有時在柱子外面有水汽凝結)，以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時使用水泵抽氣(很大的噪音，而且時間長)。
②加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使溶劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵(給魚缸供氣的就行)。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。加壓柱在普通的有機化合物的分離中是比較適用的。
③常壓柱色譜，是色譜法中常見的一種。它的突出優點是，分離效率比經典的化學分離方法高的多，與其他色譜法相比，不需要昂貴的儀器設備，更換流動相和吸附劑方便，消耗材料少，成本低，適合分離取樣量從克到微克級范圍很寬的各種樣品，因此在化學實驗室中至今仍被廣泛應用。
4.溶劑的選擇
溶劑的選擇也許是整個柱色譜分離操作中困難之處，也是實驗成功的關鍵之處,溶劑通常先利用簡便的硅膠薄層板進行篩選.
4.1薄層板點樣
把樣品溶解在一種低沸點的有機溶劑中(如氯仿,丙酮甲醇.乙醇等)然后用毛細管或微量點
樣管將試液點到薄層板上，點樣量要適當,一般點樣量少些，則分離清晰，但要注意到檢測靈敏度。
4.2點樣展開
4.2.1展開劑選擇
選擇展開劑時，可采用微量圓環法和小型色譜法進行選擇.
①微量圓環法:將欲分離的物質，按常規方法點在薄板，兩點相距2-3cm,再用毛細管吸取所實驗的溶劑系統垂直放于樣點中心，讓溶劑自毛細管中依中立流出進行展開，干燥后顯色.觀察斑點的分離情況.背試物質為未知化和物時，常先用低極性溶劑展開，如式樣留在圓點不動，則需增加溶劑的極性或增大洗脫液的量，如移動過快，則必須用較低極性的溶劑來調整。
②小型色譜法.用普通的載薄片制成薄板,把欲分離的物質點載薄板上，放于小型玻璃缸或廣口瓶中展開，干燥后顯色,觀察斑點分離情況.
4.2.2展開方法
薄層色譜的展開方法有上行法，下行法,雙向展開法，徑向展開法等：
①上行法:使展開劑由下向上爬。
②下行法:使展開劑由上向下.該法可使用極性較弱的展開劑。
③雙向展開法:取方形薄板像紙色譜一樣進行雙向展開。
④徑向展開法:可將吸附劑涂成圓形或扇形,在圓心部分加如展開劑，使薄層徑向展開。
⑤多次展開:用展開劑對薄層展開一次.稱為單次展開.一次展開后,取出薄板,揮發出去展開劑后再行展開。
⑥梯度展開:該法所用的展開劑在連續不斷的改變組成，一般可把一個裝有強極性展開劑的滴定管深入密閉的含弱極性的展開劑的層析槽中，槽中用電磁攪拌器把滴下的強極性展開劑混勻,此時,展開劑的極性逐漸由弱變強，使極性差別較大的多種組分混合物得以很好的分離。
4.3展開顯色
展開后，如物質有色，可明顯的在薄層上觀察到它們的位置，如無色，則要通過一定的方法顯色，定位,一邊確定斑點的位置及大小.
4.4常用溶劑的極性
常用溶劑的極性順序:石油醚<環已烷/已烷<苯<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<水。
刻畫極性一般用介電常數: 石油醚(無) (環) 己烷(1.88)苯(2.3)乙醚
(4.5)氯仿(5.2) 乙酸乙酯(6.1) 丙酮(21.5) <乙醇(25.8) <甲醇(31.2)<水(81.0)。
在薄層色譜中，當溶劑的極性太大時.會使待分離物全部接近溶劑前沿，當溶劑的極性太小時,又會使待分離物幾乎全部保留在圓點，這兩種情況都是待分離物得不到分離。
使用單一溶劑，往往不能達到很好的分離效果，往往使用混合溶劑通常使用一個高極性和低級性溶劑組成的混合溶劑，高極性的溶劑還有增加區分度的作用。
5.柱層析硅膠實際應用實例
5.1薄層色譜法和柱層析法分離蘭州紅心蘿卜色素的研究。
利用薄層色譜法和柱層析法對紅心蘿卜中的色素進行分離分析，著重研究了色素的量、洗脫劑、洗脫時間等因素對色素分離的影響。選擇了以硅膠為固定相，無水乙醇/水(5: 1, v/v)的混合液作洗脫劑的較好條件，單向一次性進行色譜分離。
5.2常壓硅膠柱層析分離制備高純貝殼杉烷型二萜
從半邊旗提取物中分離高純度貝殼杉烷型二萜化合物，建立了分離工藝條件。以TLC實驗篩選適當的洗脫流動相，常壓硅膠柱層析分離純化，產物用兩相法重結晶，TLC及Ms監測分離效果及產品純度。結果表明優選的流動相為混合溶劑石油醚:丙酮:醋，7:3:0.05(體積比)，純化分離得到兩個貝殼杉烷型二萜單分子化合物，純度分別從62%和17%提高到96%和94%。
5.3減壓硅膠柱層析分離苦豆子系列生物堿
利用硅膠柱層析法純化苦豆子中含有的生物堿，以氯仿、甲醇為洗脫劑，通過改變2種溶劑的混合比例進行洗脫，得到了苦參堿、氧化苦參堿和其它生物堿的單體，鑒于其它生物堿無標準品，故本文未加以討論。苦參堿、氧化苦參堿的得率分別為22.2%、42. 6%，其單體通過HPLC檢測后，純度都達到95%以上，因此可以應用硅膠柱層析法精制苦豆子中含有的生物堿。
5.4中壓柱層析法分離白藜蘆醇的研究
對虎杖中的白藜蘆醇進行了提取分離和含量測定。考察了浸提溫度、浸提液濃度、浸提時間和次數、料液比等5個因素對白藜蘆醇提取的影響，確立了白藜蘆醇較佳提取條件為:浸提液體積分數為95%，浸提溫度60°C，料液比11:1,回流提取3次，每次60min。采用中壓硅膠柱層析法分離白藜蘆醇，產物經重結晶后用高效液相色譜測定含量達99.28%。結果表明所建立的制備及分離純化工藝可用于白藜蘆醇的生產。
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