2021/09/22
一.反相薄層原理及優點：
薄層色譜法包括吸附薄層與分配薄層，在正相色譜主要使用吸附薄層色譜法，其原理是由于樣本各組分的理化性質不同，它們在吸附劑(或固定相)上的吸附作用不同，在展開劑(或移動相)中的洗脫作用(溶解度)亦不同，各組分隨展開劑由原點向預定的前沿移動時，在兩相間反復進行吸附和解吸附，吸附強的成分難于被展開劑溶解下來，移動速度小，吸附弱的成分較易被展開劑解吸附，移動速度大，移動速度的差別，使各成分分離，在連續不斷的多次吸附和解吸附過程中，分離效率是比較高的，各成分經展開后在薄層板上遷移距離的數值，可用比移值(Rf值)來表示，即試樣移動的速度與展開劑移動速度之比。
反相色譜為分配色譜，其原理主要基于樣品分子在流動相和固定相間的溶解度不同(分配作用)而實現分離的液相色譜分離模式。分配色譜原本是基于樣品分子在包覆于惰性載體(基質)上的固定相液體和流動相液體之間的分配平衡的色譜方法，因此也稱液液分配色譜。因為作固定相的液體往往容易溶。在薄層色譜中，當流動相的極性大于固定相的極性時，就形成反相TLC，一般的固定相是化學鍵合相雖然制備稍復雜，但其斑點擴散小，廣泛用于多種藥品的分離，特別適合于組分復雜的混合物的分離化學鍵合相硅膠的硅烷化程度也可為分離提供選擇性。可根據樣品性質選擇適當固定相材料，實現較好的分離效果。主要用于極性成分復雜的樣品，又可用來考察摸索HPLC的分離條件。運用經烷基化修飾的硅膠為固定相，固定相幾乎都是被化學鍵合在載體物質上，而不是機械覆蓋在它上面，制備較為復雜(現有商品板)，但其斑點擴散小，分離效率高。化學鍵合相硅膠的硅烷化程度，為分離提供選擇性，可根據樣品性質選擇適當的固定材料，實現較好的分離效果。展開劑較為簡單，通常選用水、甲醇、乙腈、四氫呋喃等有機溶劑，有時還需要兩種以上溶劑的混合展開劑。
反相薄層色譜中使用兩類固定相:
(1) 物理結合
(2) 化學鍵合。
前者的制備常用石蠟等非極性液體涂在硅膠等載體上，此固定相的缺點是穩定性和重現性較差。化學鍵和固定相具有許多優點:斑點擴散小;Rf值重現性好;點樣量較大:能廣泛用于多種樣品的分離，特別適用于分離極性強的復雜樣品(氨基酸維生素)等。化學鍵和固定相的出現使反相薄層近年來得到了迅速發展。經典薄層色譜(TLC)主要是以硅膠為固定相的吸附TLC。近幾年發表的TLC論文中，很多涉及用非極性的化學鍵和相硅膠作團定劑。例如二甲基辛基氯硅烷與硅膠反應得到辛基硅膠。非極性烷基通過Si-0-Si鍵鏈接，使這種固定相材料成為疏水的，廣泛應用于反相薄層板。
二. 反相薄層特性：
1. 重復使用：用過的鍵合薄層板只要經過干洗和干燥后就可以重新使用。例如C18反相薄層板層析后，只要用甲醇或二氯甲烷洗去層析物(在UV光下不被檢出)就可以重新使用。此板經幾次到幾十次次再生使用，未發現性能變異。(薄層板必須避免機械損壞)
2. 重現性好：在吸附TLC中，硅膠的活性常因吸附空氣中的水分而降低，用此硅膠板試驗時，層析物的RF值常常隨之變異，給鑒定帶來麻煩。而化學鍵合相硅膠則不存在這個問題，在濕度不同的試驗環境中用化學鍵合相硅膠實驗，仍然獲得重現性良好的RF值。但是，用水和醇混合溶劑混合作流動相時，為保證得到重現的RF值，應防止化學鍵合相薄層板吸附醇蒸汽。
3.
斑點擴散小。
4. 能廣泛用于多種樣品的分離，特別適用于分離極性強的復雜樣品(氨基酸、維生素)等。
5. 影響分離因素：化學鍵合固定相中烴鏈長度(含不同碳)影響分離物的 RM值。
化學鍵合相硅膠的烷基化程度也為分離提供選擇性。化合物在完全烷基化薄層板上接近溶劑(流動相)前沿，有利于分離極性物質。
為了實現較好的分離，應根據樣品性質選擇適當的固定相材料。
